Tecnica Histologica

En entregas pasadas hemos aprendido acerca de la estructura y función de la célula, pero nunca hablamos de las técnicas de estudio de la misma, es decir nunca hablamos acerca de lo que esperaríamos ver bajo el microscopio, o como se verían aquellas células y organelos de los que tanto hemos hablado a lo largo de este blog, o bajo que procesos pasaron, por lo que hoy nos daremos a la tarea de analizar de manera general los procesos a los que son sometidos los tejidos para poder ser estudiados bajo el microscopio, a lo que denominamos Técnica Histológica.

Se denomina Técnica Histológica al conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a través de los microscopios fotónicos y electrónicos.  La técnica histológica consta de los siguientes pasos: Toma de la Muestra, Fijación, Inclusión, Microtomia y Tinción. Los procesos realizados y los materiales empleados en cada paso varían de acuerdo al tejido que se procesara y a lo que se quiere observar en el mismo, por lo que aquí hablaremos únicamente de la técnica de procesamiento de tejidos en parafina, y luego subiremos más técnicas como la criofractura o la hibridación in situ.

Toma de la Muestra

La toma de la muestra puede ser por necropsia cuando está se toma de un organismo muerto o por biopsia cuando la muestra procede de un organismo vivo. La biopsia puede ser:

·         Citología Exfoliativa (raspado): Cuando se toman células que se descaman fácilmente de superficies corporales.

·         Insicional: Cuando se toma con instrumental quirúrgico una parte de tejido sano y otra de tejido enfermo.

·         Exicional: Cuando se toma todo el tejido lesionado

·         Punción: Se hace en órganos solidos con una aguja que se clava en el área de lesión

·         Aspiración: El aspirado se realiza en lesiones quísticas.

Aguja para biopsia insicional

 Fijación

La fijación es un proceso que tiene como objetivo detener la vida de las células e impedir las modificaciones post mortem que pueda sufrir la célula (procesos autolíticos), manteniendo la estructura morfológica de células y tejidos sin que ocurran cambios notables en ellos. La fijación puede ser física por congelación o química empleando sustancias como el formaldehido. Los fijadores químicos se pueden dividir en reductores y oxidantes

·         Oxidantes: tetraóxido de osmio (ácido ósmico), bicromato de potasio, ácido crómico, bicloruro de mercurio o “sublimado corrosivo”, ácido pícrico, ácido acético.

·         Reductores: formaldehído, glutaraldehído, alcohol etílico, alcohol metílico

La acción oxidante o reductora de los fijadores le confieren a las células ciertas condiciones que posibilitan una mejor aplicación de las sustancias colorantes, por ejemplo: el alcohol etílico conserva el glucógeno, el bicloruro de mercurio provoca que las anilinas coloreen de manera más brillante a las fibras colágenas, el bicromato de potasio facilita la coloración de las mitocondrias, el ácido acético permite una mejor tinción de los núcleos, el cloruro de calcio conserva e insolubiliza parcialmente a los lípidos.

El fijador químico más utilizado es el formaldehído. El formaldehido es un gas que se presenta para su uso diluido al 37 % en agua, y esta dilución se le denomina formol o formalina. Para la fijación las muestras se sumergen en formol al 10% en agua

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Inclusión

Los tejidos fijados adquieren cierta consistencia y dureza, pero no la suficiente para que, de ellos, se obtengan secciones delgadas. Estas secciones, del orden de algunas milésimas de milímetro (5 a 10 μm), se conseguirán cuando los tejidos se infiltren con sustancias denominadas “de inclusión” y adquieran tal dureza que sometidos al filo de una navaja produzcan secciones, cortes o láminas sumamente delgados y transparentes.

Existen una serie de sustancias de inclusión que se utilizan actualmente. Unas son solubles en agua (gelatina, carbowax, glicol metacrilato) otras, solubles en solventes orgánicos (parafina, celoidina, resinas epóxicas). De ellas una de las más utilizadas es la parafina.

Cualquiera que sea el medio de inclusión a emplear es indispensable que la muestra a incluir se encuentre embebida en la sustancia que disuelve al medio de inclusión. Después de la fijación de las muestras, éstas se encuentran embebidas en agua o en alcohol, por lo que resulta imposible que se infiltren con parafina, ya que es insoluble en agua y alcohol. Por lo tanto, para que los tejidos puedan ser incluidos en parafina se requiere Extraer el fijador, Deshidratarlos e Infiltrarlos con el solvente de la sustancia de inclusión. Los pasos a seguir para la inclusión de las muestras en parafina son: Extracción del fijador, Deshidratación, Diafanización, Infiltración e Inclusión

Extracción del Fijador

Se lava la muestra con agua para extraer el fijador

Deshidratación

Significa extraer o remover el agua de los tejidos fijados. Se sumerge la muestra en baños de etanol comenzando por concentraciones bajas hasta llegar a etanol absoluto. La deshidratación debe ser completa porque, de lo contrario, el solvente no actúa de forma adecuada y el bloque de inclusión no alcanza la dureza requerida. Los baños en alcohol etílico se realizan de la siguiente manera:

1.    alcohol etílico al 70 % por 12 horas

2.    alcohol etílico al 70 % por 12 horas

3.    alcohol etílico al 95 % por 1 hora

4.    alcohol etílico al 95 % por 1 hora

5.    alcohol etílico al 100% por 1 hora

6.    alcohol etílico al 100 % por 1 a 1.5 horas.

También puede usarse para este proceso: el alcohol isopropílico, el dioxano y el cloroformo.

Diafanización

Las muestras deshidratadas se encuentran embebidas en alcohol etílico absoluto; al cual la parafina tampoco es soluble, por lo que es necesario reemplazarlo por sustancias que sean capaces, de mezclarse con el alcohol y disolver la parafina. La sustancia más usada es el Xilol, en el cual se sumerge la muestra en baños de la siguiente manera:

1.    alcohol absoluto (50%) xilol (50%) por 1 hora

2.    xilol por 1 hora,

3.    xilol por 1 hora.

También se puede usar:  tolueno, benceno, y el cloroformo.

Infiltración

Se sumerge la muestra en parafina líquida en tres baños:

1.    1 a 1.5 horas,

2.    1 a 1.5 horas,

3.    30 a 60 minutos

Inclusión

Se sumerge la muestra infiltrada en un molde lleno de parafina líquida y se deja enfriar. La muestra queda incluida en un bloque de parafina.

Bloques de Parafina

Microtomia

El bloque de parafina se coloca en un microtomo, en el microtomo el bloque se desliza por una cuchilla de acero y así se obtiene el corte de la muestra. Los cortes luego se extienden en un baño de flotación con agua caliente y se recogen en un portaobjetos

Microtomo

Tinción e Histoquímica

Los portaobjetos en los que están adheridos los cortes infiltrados en parafina se sumergen en diferentes líquidos para realizar la tinción y completar la preparación de la muestra. Dependiendo de el colorante a elegir seguirán una serie de pasos y procedimientos diferentes, aunque la mayoría de las tinciones emplea la siguiente secuencia:

1.    Desparafinación: Se realiza con dos baños xilol de tres minutos cada uno

2.    Hidratación. Se realiza con etanol desde etanol absoluto, pasando por soluciones menos concentradas hasta llegar al agua pura de la siguiente manera: 2 baños de alcohol al 100% por tres minutos, 2 baños en alcohol al 95% de 3 minutos cada uno, 1 baño en alcohol al 70% y un baño en agua ordinaria, ambos por 5 minutos

3.    Tinción. El proceso varia dependiendo el colorante que se use

4.    Deshidratación. Con concentraciones crecientes de etanol de la siguiente manera: 1 baño en alcohol al 70% por un minuto, 2 baños en alcohol al 95% por un minuto cada uno, 2 baños en alcohol al 100% por 1 y 2 minutos respectivamente

5.    Aclaramiento. Con xilol en 2 baños de 1 y 2 minutos respectivamente.

6.    Montaje. Concluido el proceso de la tinción de los cortes, éstos se deben colocar en condiciones de protección para poderlos utilizar infinidad de veces sin que se deterioren, para ello se montan en resinas naturales o sintéticas.

Existen otros procedimientos en la técnica histológica que permiten la observación de células y tejidos en los cuales no se utilizan colorantes. Estos procedimientos emplean sales de metales pesados, los cuales se ponen en contacto con los componentes celulares y tisulares a través, de sustancias reductoras u oxidantes que se depositan en algunas de ellas (precipitación o impregnación). Al conjunto de procedimientos se les conoce como impregnaciones metálicas.

A continuación, hablaremos de las tinciones más utilizadas en histología y que es lo que consigue apreciarse al observar la muestra en el microscopio. También abordaremos algunas técnicas de impregnación metálica e inmunohistoquímica.

Tinciones Más Utilizadas

Hematoxilina-Eosina (H-E)

Esta es una tinción denominada bicromica, ya que emplea dos colorantes: la hematoxilina y la eosina, los cuales tiñen todos los componentes de la célula dependiendo si con basófilos o acidófilos. La HEMATOXILINA es un colorante básico que tiñe de color morado las estructuras ácidas de la célula, las cuales se denominan BASOFILAS, las estructuras basófilas son: el núcleo, puesto que allí se encuentran los ácidos nucleicos, los ribosomas y el retículo endoplásmico rugoso. Por otra parte, la EOSINA es un colorante Acido que tiñe de color rosa las estructuras básicas de la célula denominadas ACIDOFILAS, las cuales son: todas aquellas ubicadas en el citoplasma.

En resumen:

·         Componentes Basófilos: MORADO

·         Componentes Acidófilos: ROSA

 

Piel Teñida con H-E

Tinciones Tricromicas

Las tinciones Tricromicas se llaman así porque emplean tres colorantes. Su principal objetivo es resaltar las fibras de colágeno del tejido conectivo respecto al resto de estructuras tisulares.  Los tricrómicos contienen un colorante nuclear y al menos dos colorantes amónicos que se utilizan en asociación con una molécula de tipo heteropoliácido. Los dos heteropoliácidos usados en las tinciones tricrómicas y otras tinciones histológicas son el ácido fosfomolíbdico (PMA) y el ácido fosfotúngstico (PTA). El efecto de la asociación entre estos dos tipos de moléculas es la coloración selectiva de las fibras de colágeno por uno de los colorantes amónicos. Ese es precisamente el rasgo peculiar de toda tinción tricrómica: la tinción específica de las fibras colágenas. Además, el cartílago y algunas secreciones mucosas se tiñen del mismo color que el colágeno, pero menos intensamente. Algunas de las tinciones tricrómicas más usadas son: Tricromico de Gomori, Tricromico de Gallego, Tricromico de Masson:

Tricromico de Masson

Usa un colorante nuclear (hematoxilina férrica de Weigert), un colorante aniónico fucsina ácida, otro colorante rojizo, que puede ser el colorante azo ponceau 2R (también llamado ponceau de xilidina, CI 16150) y un colorante aniónico que tiña las fibras de colágeno, que puede ser azul de anilina o fast green. Las estructuras que se identifican con Tricromico de Masson son:

·         Núcleos: MORADO/CAFE

·         Citoplasma y Fibras Musculares: ROJO

·         Fibras de Colágena: AZUL

 

Lengua Teñida con Tricromico de Masson

Tricromico de Gallego

El colorante nuclear es la fucsina acética y como colorante citoplasmático o extracelular el Picro Índigo Carmín, que consiste en varios colorantes. Las estructuras que se identifican con Tricromico de Gallego son:

·         Núcleos: MORADO/CAFE

·         Citoplasma y Fibras Musculares: VERDE/AMARILLO

·         Fibras de Colágena: AZUL/VERDE

Piel teñida con Tricromico de Gallego

Tricromico de Gomori

Esta técnica combina un colorante plasmático (cromotropo 2R) y un colorante de fibras conectivas (verde luz/azul de anilina) en una solución de ácido fosfotúngstico y ácido acético. Las estructuras que se identifican con Tricromico de Gomori son:

·         Núcleos: AZUL/NEGRO

·         Citoplasma y Fibras Musculares: ROJO

·         Fibras de Colágena: VERDE

Hígado teñido con Tricromico de Gomori

Wright y Giemsa

Es una tinción general que se emplea mucho en hematología, ya que permite distinguir, por su coloración, los gránulos de los diferentes leucocitos polimorfonucleares. Aunque se utiliza muy frecuentemente en extensiones celulares, también puede usarse en cortes de tejidos. Contiene una mezcla de colorantes catiónicos (azul de metileno, azur A o B) y amónicos (eosina). Se emplea también en técnicas para demostrar células endocrinas.

Frotis Sanguineo teñido con Giemsa

Papanicolau

La citología cervical es uno de los estudios clave en el diagnostico oportuno del cáncer cervicouterino, dicho estudio ha sido mal nombrado en múltiples ocasiones como Papanicolau, sin embargo, lo único que lleva ese nombre es la tinción con la cual es teñida la muestra obtenida en este estudio. Es una técnica policromica que tiene cuatro colorantes: uno nuclear, normalmente una hematoxilina alumínica; eosina, que tiñe de rosa los citoplasmas de las células epiteliales, los eritrocitos, etc.; el verde brillante (light green), que tiñe el moco, y un colorante que tiñe la queratina (Orange G).

Frotis Vaginal teñido con Papanicolau

Impregnaciones Argénticas

Se denomina impregnación» a toda coloración histológica en la que se emplean sales metálicas, como el cloruro de oro (AuCl₃) o el nitrato de plata (AgNO₃), para generar precipitados metálicos sobre las estructuras que se pretende destacar.

Las técnicas de impregnación argéntica han sido decisivas para el estudio de la organización del tejido nervioso. Estos métodos fueron descritos por primera vez por Camillo Golgi, que dio un gran impulso a los estudios del sistema nervioso, y fueron perfeccionados, entre otros, por Santiago Ramón y Cajal.

En general, los protocolos de impregnación argéntica implican dos pasos. En el primero denominado impregnación primaria, los tejidos son expuestos a una solución ligeramente alcalina en la que hay una concentración no muy alta de AgNO₃, que proporciona iones de plata Ag⁺ en exceso. El exceso de Ag⁺ se consigue mediante un volumen grande de la solución de AgNO₃.  Los iones Ag⁺ generados desde estas se relacionan con las estructuras del tejido que se va a teñir de dos maneras. Unos pocos iones Ag+ interaccionan con las estructuras que se teñirán: estos iones son reducidos a plata metálica en puntos muy concretos de los axones y las dendritas.  La plata reducida forma pequeños núcleos de plata metálica invisibles al microscopio, incluso al electrónico convencional. Estos puntos son los equivalentes a la imagen latente que se forma en el negativo fotográfico cuando es impresionado por la luz.

En una segunda fase de los métodos de impregnación argéntica, los cortes son tratados con una solución similar a la que se usa para el revelado de los negativos fotográficos; es decir, una molécula reductora, combinada con otra molécula que captura parte de los iones de plata que se han unido débilmente al tejido. Una combinación típica es la de hidroquinona y sulfito. El sulfito se combina con los iones Ag⁺ libres para formar iones [Ag (SO₃)₂]^3_. La hidroquinona reduce estos iones y precipita plata metálica sobre los puntos de nucleación que se han formado en la impregnación primaria.

La impregnación argéntica se basa, por tanto, en la interacción de determinadas estructuras del tejido con los iones Ag⁺ y en la capacidad de estas estructuras de formar puntos de nucleación de Ag° metálica.

Celulas de Golgi del cerebelo con Impregnación Argentica

Detección de Carbohidratos

PAS

En esta técnica se utilizan dos reactivos principales, el ácido peryódico y el reactivo de Schiff, con los que se demuestra la presencia de un elevado número de polisacáridos. Cuando estás moléculas están presentes se tiñen de color rosa fucsina y se dice que son PAS+, también se puede tener un efecto similar con carmín de best y mucycarmin de Meyer.

Intestino teñido con PAS

Detección de Ácidos Nucleicos

Feulgen

La técnica de Feulgen es un método específico para demostrar la presencia de ADN en un tejido y también se basa en el reactivo de Schiff. El ADN se tiñe de color rosa fucsina

Lirio teñido con Feulgen

Verde Metilo-Pironina

Utiliza dos colorantes: verde de metilo y la pironina, que tiñen, respectivamente, el ADN y el ARN. El verde de metilo es un colorante básico que, en condiciones óptimas, es específico para el ADN (núcleo), al que tiñe de verde. La pironina tiñe el ARN (nucléolo y ribosomas en la célula) de rojo. Controlando bien las condiciones de esta técnica, podemos obtener un núcleo verde, mientras que el nucléolo, los ribosomas y el retículo rugoso quedan de color rojizo

  

Detección de Lípidos

Sudan Rojo y Negro

La tinción de lípidos con Sudán negro se produce por un mecanismo de disolución diferencial. Puesto que los lípidos son solubles en alcohol, ha de evitarse todo paso que requiera alcohol (deshidratación, etc.) y por ello es preferible utilizar material congelado o fijado en osmio. A la hora de montar la preparación, se utilizan, por el mismo motivo, medios de montaje hidrosolubles, como el glicerol/PBS (1:1). Los lípidos son apreciados de color negro tanto con sudan rojo como con sudan negro.

Detección de Proteínas

Inmunohistoquímica

Esta técnica utiliza un anticuerpo contra la proteína en concreto que se desea localizar y el marcado del anticuerpo con colorante fluorescente. Se conocen dos métodos para el marcaje de anticuerpos el directo y el indirecto. En el método directo el anticuerpo de la molécula se marca con un colorante fluorescente, después se deja que este reaccione con la macromolécula que se desea localizar   y se visualiza el complejo con un microscopio de fluorescencia. En el método indirecto primero se necesita un anticuerpo contra la molécula de interés el cual reacciona con la molécula de interés, y luego se requiere otro anticuerpo marcado con un colorante fluorescente contra el anticuerpo especifico, posteriormente este reacciona y se observa el complejo al microscopio de fluorescencia.

Inmunohistoquimica metodo directo e indirecto

Inmunohistoquimica anti-tubulina

Identificación de Organelos con Tinciones Subcelulares

Retículo Endoplásmico Rugoso

Se puede apreciar a través de la tinción con azul de toluidina a través de los corpúsculos de Nissl

Corpusculos de Nissl

Nucleolo  

Se puede apreciar con azul de toluidina, violeta de cresilo, y verde metilo-pironina

Mitocondria

En células vivas se puede apreciar con verde Jano, y en cortes de parafina con fucsina de Altmann

Aparato de Golgi.

Fue visualizado por los primeros neuro histólogos mediante impregnaciones argénticas 50 años antes de que se hiciera visible mediante microscopía electrónica. En general, las técnicas consistían en añadir al formaldehído una sustancia adicional (cloruros o nitratos) para intensificar la argirofilia del aparato de Golgi y luego realizar una técnica de nitrato de plata reducido sobre los cortes. La técnica argéntica modificada de Cajal en tejidos fijados con formaldehído y cloruro de bario se utiliza para identificar el aparato de Golgi. También se pueden emplear la técnica de Da Fano para identificarlo.

Imagen Negativa

No todos los colorantes se unen a las estructuras tisulares. Algunas tinciones se basan en la exclusión de la coloración. La imagen negativa consiste en teñir todo menos la estructura que queremos visualizar. Es decir, se trata de una tinción basada en las estructuras que no son teñidas por el colorante. Un ejemplo es con la técnica de Da Fano que permite apreciar al Núcleo por imagen negativa.

En resumen, la técnica histológica nos permite preservar las muestras de tejidos para su estudio a detalle en el microscopio, a quien dedicaremos nuestra siguiente entrega para hablar de los sistemas de microscopia óptica y electrónica.

  

 Fuentes

Gartner, Leslie P. Texto De Histología Atlas a Color. 4 ed., Elsevier, 2017.

Badía, Luis Montuenga et al. Técnicas En Histología Y Biología Celular. 2 ed., 2014.